Когда диагноз лотерея: от редких мутаций спасет расшифровка генома

"В моей практике была одна большая семья из Самары, страдавшая наследственной моторно-сенсорной нейропатией (НМСН). Это заболевание неприятное, но не смертельное. Первые симптомы появляются еще в детском возрасте, к шестидесяти годам пациент уже в инвалидной коляске. У нас ушло около пятнадцати лет, чтобы определить ген, вызывающий заболевание. Молекулярную причину болезни установили в 2015 году. Сейчас уже проведено шесть ранних пренатальных диагностик для разных веток этой семьи. К сожалению, не все с благоприятным прогнозом. В таком случае беременность прерывается. Но в результате все эти люди родили здоровых деток. Представляете, пять поколений семьи страдали от НМСН, а у их потомков этой мутации уже не будет", — рассказывает Ольга Щагина, врач — лабораторный генетик.

Она возглавляет лабораторию молекулярно-генетической диагностики в Медико-генетическом научном центре (МГНЦ). Именно здесь, в святая святых отечественной медицинской генетики, расшифровывают геномы россиян, чтобы отыскать в ДНК бомбу замедленного действия. Лаборатория занимает два этажа МГНЦ и состоит из нескольких изолированных помещений. Биологические образцы, взятые у пациента (чаще всего это кровь), пройдут через каждое из них, прежде чем врач узнает, что скрыто в генах.

Облачко ДНК

Сначала сотрудники лаборатории выделяют из ядра клеток ДНК, добавляя в кровь вещества, разрушающие клеточную оболочку. Полученную ДНК очищают от продуктов разложения с помощью изопропилового и этилового спирта.

"Подождите, сейчас вы все увидите", — улыбается Щагина, бережно раскачивая маленькую пробирку с бесцветным спиртовым раствором.

От плавных ритмичных движений в середине пробирки образуется маленькое белое облачко.

"Это и есть ДНК. Она бесцветная, но вот так мы можем ее на мгновение увидеть", — объясняет она.

Мои попытки сфотографировать спираль безуспешны, облачко пропадает так же быстро, как сформировалось. А пробирка с прозрачной жидкостью и содержащейся в ней кислотой отправляется в центрифугу, которая отделит биологическую молекулу от спиртов.

К мутациям приводят спонтанные химические изменения нуклеотидов в структуре ДНК

Размножить и прочитать

Через несколько минут сотрудники лаборатории достают пробирки с очищенной ДНК из центрифуги и относят их в другое помещение, где молекулу размножат, пометят и доведут до состояния, когда ее можно будет прочесть в секвенаторе — шифровальной машине генома.

"Если мы хотим прочитать небольшой отрезок гена, то проводим секвенирование по Сэнгеру. Кстати, именно таким способом в 2003 году была впервые расшифрована последовательность человеческой ДНК. Мы разбиваем ген на маленькие фрагменты, размножаем их при помощи полимеразной цепной реакции и получаем очень большое число копий для исследования. Этот метод работает, когда мы понимаем, где надо искать. Например, известно, что фенилкетонурия в 95 процентах случаев вызывается мутацией в гене PAH. Если же нужно прочитать сразу несколько генов или даже полный геном, то используется секвенирование нового поколения", — рассказывает Щагина.

Несколько небольших серых приборов со встроенными дисплеями в просторном помещении на первом этаже МГНЦ и есть секвенаторы последнего поколения. С ними управляется хрупкая Ольга Миронович, научный сотрудник лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ.

"Мы смешиваем реактивы с подготовленными образцами ДНК, вставляем их в секвенатор, туда же помещаем специальный чип. Реактивы и ДНК переносятся на чип, и все это много-много раз фотографируется. Программное обеспечение трансформирует полученные снимки в данные, которые можно читать и интерпретировать". Миронович тщательно закрывает крышку прибора и запускает секвенатор.

"Конкретно эта ДНК будет расшифрована через двадцать один час. Затем биоинформатики займутся интерпретацией полученных результатов", — добавляет она.

Расшифровка человеческого генома в Медико-генетическом научном центре

Заведующий лабораторией функциональной геномики МГНЦ Михаил Скоблов. Его исследовательская команда моделирует различные варианты мутаций на живых организмах, чтобы узнать, какой именно ген спровоцировал развитие болезни. За последние годы ученые МГНЦ впервые в мире экспериментально доказали патогенность некоторых мутаций для генов SPTB, PALB2, MYH7, COL6A3, PAX6.

Сначала из клеток крови выделяют ДНК при помощи веществ, разрушающих клеточную оболочку (ДНК содержится в ядре). Сотрудница лаборатории молекулярно-генетической диагностики МГНЦ показывает образцы с выделенным ДНК. В осадке — продукты распада клеточной оболочки.

Дезоксирибонуклеиновую кислоту очищают от продуктов разложения клетки с помощью изопропилового и этилового спирта. Затем пробирки отправляются в центрифугу, где биологическая молекула будет отделена от спиртов.

Амплификаторы — приборы, позволяющие размножить ДНК методом полимеразной цепной реакции. Для проведения качественного секвенирования необходимо много копий ДНК.

Образцы ДНК могут храниться несколько лет в обычных морозильниках при температуре -20 градусов Цельсия. Это очень важно для людей, имеющих в семейном анамнезе подтвержденные случаи генетических заболеваний.

Приборы для проведения секвенирования по Сэнгеру. Этот метод используется для расшифровки небольших фрагментов гена, в котором предполагается найти мутацию. Именно таким способом в 2003 году впервые было выполнено полное секвенирование человеческого генома.

Читать научились, а понимать не всегда

"Анализ экзома, то есть генов, отвечающих за кодирование белков, занимает как минимум три недели. Это если на всех этапах все шло хорошо и более-менее понятно из клинического анамнеза, что искать. В России, да и во всем мире, не так много специалистов, способных понимать расшифрованные гены", — объясняет генетик Оксана Рыжкова, руководитель центра коллективного пользования МГНЦ.

Именно к ней и ее сотрудникам попадают данные с секвенатора после того, как он заканчивает работу.

"Смотрите, вот у меня на компьютере результаты расшифровки клинического экзома пациента — 6300 генов, патогенные варианты в которых приводят к развитию наследственных заболеваний. Это изменения, выявленные в сравнении с референсным геномом (эталоном генома, составленным учеными как общий репрезентативный пример генетического кода). Всего 13 129 замен. Узнать, какой из этих вариантов и есть причина заболевания, очень сложно. Поэтому мы подключаемся к международным базам данных, где выложены как патогенные варианты генов и ассоциированные с ними заболевания, так и варианты, описанные как доброкачественные, не приводящие к клиническим проявлениям, и сравниваем с ними наши варианты. После этапа "фильтраций" по патогенности, частоте встречаемости и многим другим остается 15-30 изменений. Дальше будем анализировать их максимально подробно, используя дополнительные базы данных и программы определения патогенности, читать статьи, сравнивать симптомы пациента с теми, которые описаны в литературе. Только после этого можно сделать вывод, каким именно вариантом вызвано заболевание", — уточняет Рыжкова.

Как открывают наследственные болезни

Загадки CRISPR-Cas: как создают генно-модифицированных животных

Если данных о предполагаемом гене-виновнике недостаточно, то врачи-генетики обращаются за помощью к ученым-генетикам. Команда исследователей из лаборатории функциональной геномики МГНЦ, моделируя различные варианты мутаций на живых организмах, доказывает или опровергает гипотезы относительно генов, ответственных за те или иные болезни.

Во время таких исследований ученые открывают новые генетические взаимосвязи.

"В год мы описываем около десятка новых генов, виновных в наследственных заболеваниях. Вот совсем недавно обнаружили, что мутация в гене KIAA1019 вызывает нарушения развития плода, несовместимые с жизнью. В МГНЦ обратилась пара, у которой три беременности прерывались на ранних сроках. Мы секвенировали ДНК плода и нашли новые мутации в совсем не изученном гене KIAA1019. Проведя эксперименты на клеточных линиях, доказали, что найденные у родителей мутации приводят к полной поломке гена KIAA1019, что вызывает множественные пороки развития у плода. А когда известна мутация, ею можно управлять. В следующую беременность врачи провели раннюю пренатальную диагностику, плод оказался носителем мутации только в одном гене. Значит, в этой семье на свет появится совершенно здоровый ребенок. Если бы мутация пришла от обоих родителей, то беременность была бы прервана", — рассказывает Михаил Скоблов, заведующий лабораторией функциональной геномики.

Скоблов уверен, что будущее медицинской генетики именно в такой профилактике наследственных генетических заболеваний. Похожих взглядов придерживаются и сами пациенты. По словам председателя Всероссийского общества орфанных заболеваний Ирины Мясниковой, семьи с генетическими проблемами должны иметь возможность провести бесплатную предгестационную и пренатальную диагностику.

"Стоимость такой диагностики и стоимость терапии для больных наследственными заболеваниями несопоставимы. Это всем выгодно: и государству, потому что не понадобится тратить ресурсы на терапию, и семьям, потому что у них будут здоровые дети", — заключает Мясникова.

Источник: РИА Новости